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优化人脐带来源间充质干细胞体外培养的最佳方法

背景:目前关于脐带间充质干细胞培养方法的研究很多,但尚无关于初次培养后废弃物的相关研究。

最近几年里,对成体干细胞疗法的研究在不断增加。间充质干细胞是一个相当具有吸引力的种子细胞,可以用于治疗各种疾病,包括神经系统疾病,心血管疾病,自身免疫性疾病、内分泌疾病等。脐带来源的间充质干细胞是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的原始干细胞,其分化能力强,倍增时间短,具有免疫调节作用和较低的免疫原性,且无致肿瘤性。 1976年Friedenstein等首先从脐带组织中分离培养出间充质干细胞,之后Schugar等又采用了组织块法和酶消化法两种方法分别培养出脐带间充质干细胞,这也是目前较为常用的两种方法。这两种方法分离培养出的脐带间充质干细胞形态、生长曲线、细胞表面标记物等无明显差异。但是,酶消化法成本较高;操作比较繁琐污染概率大;消化过程时间过短细胞很难爬出;消化时间过长易损伤细胞;长时间酶的消化对细胞损伤较大, 多次传代后细胞易脱落死亡。 本实验采用组织块培养法提取脐带中间充质干细胞。通常来讲组织块贴壁法是将小的组织块均匀铺于培养瓶底,原代细胞从组织块边缘爬出。虽然组织块贴壁法方便易行,操作简单,但存在原代细胞收获率低、培养周期长等问题,难以适应组织工程对种子细胞的需要。本实验中初次培养组获取原代细胞的平均时间大约2周,获取细胞数量较少,符合组织块贴壁法培养的结果。一般传代结束后就会将培养原代细胞的组织和培养液丢弃。本实验是将废弃的组织和培养液离心后,分成组织组、混合组和纯液组进行再次培养,大约1周即可传代,且获取的细胞数为初次培养的2倍左右。相对于传统组织贴壁法,这种改进的方法可在较短时间内获得大量原代细胞。因此,对脐带间充质干细胞的原代培养体系进行再次培养,可以在短时间内扩增出大量原代细胞。 从文章结果中对于初次培养组和再次培养组织组、混合组、纯液组的比较可以推测:初次培养后组织块内细胞并未完全爬出;在初次培养的过程中可能形成了某些黏附物质和生长因子,能促进组织块贴壁和生长;组织块再经过一轮培养后,纤维组织松解,细胞易于爬出;原代培养的培养液中可能存在一些散在细胞。本文仅是针对高效率扩增细胞进行研究,其进一步机制和原因有待于做深入研究。 综上所述,在传统组织块贴壁法的基础上进行再次贴壁培养,得到的脐带间充质干细胞在形态、生长曲线、增殖速率、免疫表型等方面与初次培养的细胞无明显差异。相对于传统组织贴壁法,这种再次培养的方法具有成本低、操作简单、易于短时间内获取大量原代细胞等优点,可以为再生医学提供足够的种子细胞。

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目的:探讨优化人脐带来源间充质干细胞体外培养的最佳方法。

干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,它既可以通过细胞分裂维持自身群体的稳定,又可以分化成为不同类型细胞,进而构成机体各种复杂的组织器官。对于干细胞的研究可追溯到20世纪50年代,最早源于对畸胎瘤的研究。20世纪70年代,人们就发现了一种来源于中胚层、成纤维样贴壁生长的细胞,称之为间充质干细胞 间充质干细胞是干细胞家族的重要成员,因具有很强的自我更新和向多种组织分化发育的潜能而日益受到人们的关注。目前已从骨髓、脂肪、羊膜、胎盘、脐血以及脐带等组织中分离出间充质干细胞,其有向内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞分化的能力。脐带来源广泛,取材方便,易于收集、保存、冷冻,属于医疗废弃物,不受伦理、道德及法律方面的限制,并且可在体外进行分离、培养,生物性能稳定,多次传代扩增仍能保持旺盛功能。脐带间充质干细胞在再生医学研究中具有极大潜质和广阔应用前景。 目前,随着生物医学研究的不断深入,按照一定的目的在体外培养扩增干细胞已成为现实。但是如何才能在短时间内获取大量的脐带间充质干细胞仍需要进一步研究。本实验以贴壁法为基础,对初次培养废弃的组织块、培养液及其混合物进行再次培养,力求降低成本、简化操作、提高质量、高效率的获得细胞。

方法:采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,记为初次培养组。将原代培养瓶中的培养液及组织离心,重新分成组织组、混合组和纯液组进行再次培养。观察4组原代细胞的细胞形态、获得时间和细胞得率;MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型。

设计:多样本观察实验。

时间及地点:实验于2013年9月至2014年2月在解放军海军总医院心脏中心实验室完成。

材料:

 

脐带标本经医院伦理委员会批准,征得产妇和家属书面知情同意的情况下,在解放军海军总医院妇产科取当日剖宫产健康足月生产的新生儿脐带(乙型肝炎病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、TP-SX、巨细胞病毒、梅毒、艾滋病等传染性疾病检测阴性)。
实验方法:
人脐带间充质干细胞的分离、培养将无菌条件下获取的脐带放入无菌生理盐水中,1 h之内送至细胞培养实验室。参照文献[14]报道的人脐带间充质干细胞分离、培养方法,用生理盐水反复冲洗,洗去脐带残留血液,将脐带剪成3.0-4.0 cm的小段,每段均沿脐静脉腔剪开,平铺后剔除静脉,再剔除2根动脉,取出血管之间、血管与外膜之间的胶状物——华通胶,用小剪刀将取出的华通胶反复剪切成大约1 mm3小块,接种于T75培养瓶内,每个培养瓶内加入10 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,使脐带华通胶均匀分布瓶底,置于体积分数为5%CO2、37 ℃的培养箱内培养。在显微镜下观察细胞生长增殖情况并拍照。待细胞生长至80%-90%融合状态时,用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞,记为初次培养第1代细胞(P1)。
人脐带间充质干细胞的再次培养将原代培养瓶中的废弃物移入离心管中,1 500 r/min离心5 min,将沉淀的组织块置于培养瓶中加入新的培养基(含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液),记为再次培养组织组;将离心后的上清液(原培养液)8.0-10.0 mL置于培养瓶中,记为再次培养纯液组;取部分沉淀的组织块及离心后的上清液(原培养液)4.0-5.0 mL置于培养瓶中,并加入4.0-5.0 mL新的培养基,记为再次培养混合组。将以上3组分别置于体积分数为5%CO2、37 ℃的培养箱内培养。在显微镜下观察细胞生长增殖情况并拍照。待细胞生长至80%-90%融合状态时,用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞,记为再次培养第1代细胞(组织P1;混合P1;纯液P1)。
人脐带间充质干细胞表面标记物检测取初次培养和再次培养的第3代脐带间充质干细胞,0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗2次,调整细胞浓度为1×109 L-1单细胞悬液,每个Eppembrf 管加100 μL的细胞悬液,每种抗体设置4个复管,分别为初次培养组,再次培养组织组,再次培养混合组,再次培养纯液组,加入鼠抗人单克隆抗体 PE-CD90,PE-CD105,PE-CD44,PE-CD73,PE-HLA-ABC,FITC-CD45,FITC-CD34,FITC-HLA-DR各20 μL,充分混匀,避光室温孵育30 min,PBS洗2遍(250×g离心5 min),重新制成细胞悬液0.5 mL,经300目细胞筛过滤,流式细胞仪上机检测并分析。
MTT法检测细胞增殖活性取第3代初次培养组、再次培养组织组、再次培养混合组、再次培养纯液组细胞,经0.25%胰蛋白酶消化计数后,分别用完全培养基调整细胞浓度至2.5×107 L-1,取200 μL细胞悬液接种在96孔板中,每组设6个副孔,共设7组,置于37 ℃,体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每隔24 h向6孔中加入20 μL MTT溶液(5 g/L,用PBS配),继续孵育4 h,用无细胞的培养液做空白对照,酶标仪检测各组细胞吸光度值(激发波长 490 nm),连续7 d,取6孔均值绘制生长曲线。
细胞周期测定取第3代初次培养组、再次培养组织组、再次培养混合组、再次培养纯液组细胞,经0.25%胰蛋白酶消化收集后,分别用PBS离心洗涤2次,调整细胞浓度至1×109 L-1,离心弃上清,加入4 ℃预冷的体积分数为70%乙醇1 mL重悬,4 ℃冰箱过夜,离心弃上清,用1 mL碘化丙啶重悬,4 ℃避光孵育30 min,流式细胞仪检测,分析细胞周期。
主要观察指标: ①不同组分的人脐带间充质干细胞形态、获得时间、细胞得率等情况。②不同组分的人脐带间充质干细胞免疫表型。③不同组分的人脐带间充质干细胞增殖能力。④不同组分的人脐带间充质干细胞的细胞周期。
统计学分析:数据以x_±s表示,用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,以配对t 检验进行双侧显著性检验,P < 0.05为差异有显著性意义。

结果与结论:初次培养组、再次培养组织组、再次培养混合组、再次培养纯液组获取细胞的平均时间分别为(15.00±0.45) d,(7.0±0.3) d,(8.00±0.25) d,(8.00±0.25) d。每个T75培养瓶可获取的第1代细胞数分别为(4.0±0.5)×105、(9.0±0.55)×105、(15.0±0.2)×105、(7.0±0.33)×105个。倒置显微镜下观察4组细胞为形态相对均一的梭形贴壁细胞,呈平行排列生长或漩涡状生长。4组细胞的生长曲线、增殖活性、表面标记物检测均无明显差异。结果表明对脐带间充质干细胞的原代培养体系进行再次培养,可在短时间内扩增出大量原代细胞。

2.1 各组原代人脐带间充质干细胞形态、获得时间、细胞得率等情况分析 倒置显微镜下观察4组原代细胞呈贴壁生长,形态均为长梭形或多角形(1)。



初次培养组细胞以华通胶为中心呈漩涡状或平行排列生长,获取细胞的平均时间为(15.0±0.45) d,平均每个T75培养瓶可获取(4.0±0.5)×105个第1代细胞;再次培养组织组细胞以华通胶为中心呈漩涡状生长,获取细胞的平均时间为(7.0±0.3) d,平均每个T75培养瓶可获取(9.0±0.55)×105个第1代细胞;再次培养混合组部分细胞以华通胶为中心呈漩涡状生长,部分细胞呈散在生长,得到原代细胞的平均时间(8.0±0.25) d,平均每个T75培养瓶可获取(15.0± 0.2)×105个第1代细胞;再次培养纯液组细胞呈散在生长,得到原代细胞的平均时间(8.0±0.58) d,平均每个T75培养瓶可获取(7.0±0.33)×105个第1代细胞。

传至第3代,细胞增殖速度加快,形态较为均一呈长梭形,折光度好。
结果表明,4组细胞形态无明显差异,初次培养组原代细胞培养时间显著高于其他3个再次培养组,差异有显著性意义(P < 0.05),再次培养3个组之间两两比较,差异均无显著性意义(P > 0.05)。4组所获取的原代细胞数比较,再次培养混合组数目最多,再次培养组织组其次,再次培养纯液组稍差,初次培养组最少,4组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.2 各组人脐带间充质干细胞免疫表型分析 流式细胞仪检测结果显示(表1),4组第3代脐带间充质干细胞均高表达CD90、CD105、HLA-ABC,不表达 CD31、CD34、CD45、HLA-DR,且4组培养方法所获取的细胞表面标志物的阳性表达率差异无显著性意义(P > 0.05)。





2.3  各组人脐带间充质干细胞增殖能力分析 MTT法绘制4组第3代人脐带间充质干细胞的生长曲线(2)。4组人脐带间充质干细胞生长曲线形态相似,1至2 d细胞处于潜伏期,增殖不明显;3-5 d细胞进入对数生长期,细胞增殖加速;第6天以后进入平台期,细胞生长停滞。4组间生长曲线比较差异无显著性意义(> 0.05)。



2.4  各组人脐带间充质干细胞的细胞周期分析 用流式细胞仪检测4组第3代人脐带间充质干细胞的细胞周期(3)。

结果显示(75.28±0.55)%的人脐带间充质干细胞处于G0/G1期,其余细胞处于增殖分裂期,且各组间G0/G1期细胞比例差异无显著性意义(P > 0.05)。说明这4组细胞增殖能力旺盛,且差异无显著性意义。



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